RPPA过程

RPPA方法和数据处理

用RPPA裂解缓冲液裂解冷冻肿瘤/细胞微球，提取蛋白(见抗体信息及方案页面)。裂解液用裂解缓冲液手工连续稀释5次两倍稀释，并使用Aushon Biosystems 2470 arrayer打印在硝化纤维素涂层的载片上。切片中检测大约300个有效的一抗，然后检测适当的生物素化二抗(山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG或兔抗山羊IgG)。利用细胞催化的亲和素生物素化过氧化物酶(Vector Lab的Vectastain Elite ABC试剂盒)与二抗结合，催化酪氨酸-生物素偶联形成不溶性生物素化酚，扩增得到的信号。信号通过二级链霉亲和素偶联HRP和DAB比色反应显示。使用Array-Pro分析软件(MediaCybernetics)对载玻片进行扫描、分析和量化，生成光斑强度(1级数据)。SuperCurve GUI(2)，用于估计相对蛋白水平(log2量表)。拟合曲线(“supercurve”)创建与轴和相对信号强度log2大量使用非参数x轴上的每个蛋白质,单调递增b样条模型(1)原始点强度数据调整到正确的空间偏差模型拟合之前使用“控制斑点”排列在幻灯片(3)。质量控制指标(4)为每个幻灯片来确定生成质量,只有幻灯片为0.8 0 - 1范围内进一步使用。对于重复切片，使用QC评分最高的切片进行分析(二级数据)。按照所述(2,5)，通过抗体中位中心校正蛋白质测量值(3级数据)。 Samples with low protein levels were excluded from further analysis. Antibodies were selected to represent the breadth of cell signaling and repair pathways (7) conditioned on a strict validation process as previously described (6). Antibodies are labeled as “validated” and “use with caution” based on degree of validation.

1.等人。反相蛋白阵列:一种新的蛋白质组学技术的验证和分析原发性白血病标本和造血干细胞的效用。《其他癌症》5,2512 -2521 (2006)

2.Hu J, He X, Baggerly KA, Coombes KR, Hennessy BTJ, Mills GB。(2007)蛋白质裂解物阵列的非参数量化。生物信息学,23岁,1986 - 94。

3.Neeley ES, Baggerly KA, Kornblau SM。(2012)利用阳性控制点对反相蛋白阵列进行表面调整。癌症通知。11,77 -86。

4.Ju z等。一种鲁棒分类器的发展质量控制的反相蛋白质阵列。生物信息学31,912 -918 (2015)

5.冈萨雷斯-安古洛，A.M.等。功能蛋白质组学可以确定乳腺癌患者的预后和预测病理完全缓解。中国。蛋白质组学8 - 11 (2011)

6.轩尼诗，B.T.等。反相蛋白阵列在非微解剖的人类乳腺癌中功能蛋白组研究中的应用技术评估。中国。蛋白质组学6,129 -151 (2010)

7.阿克巴尼(Akbani R, Ng KS)Werner HMJ。， Shahmoradgoli M, Zhang F, Ju。赵，刘文伟，杨继元，吉原康，李静，凌生。Seviour如。、Ram PT.、Minna JD.。，刁l. Tong P. Heymach Jv。,希尔SM。， Dondelinger F, Stadler N, Byers LN。， Meric-Bernstam F, Weinstein HN。,扫帚BM。, Verhaak RGW。梁H，慕克吉S，卢Y和米尔斯GB。, 2014 A pan-cancer proteomic perspective on the Cancer Genome Atlas Nature Comms: 5:3887 PMID:24871328 PMC4109726