电穿孔技术靶向基因

胚胎干细胞的基因靶向技术是在特定的染色体位点上引入突变的一项有力技术。该技术是基于实验证明外源DNA可以在培养的细胞中通过同源重组精确地整合到基因组中。随着ES细胞技术的出现，通过同源重组来改变靶基因，同时保持细胞的多能性状态的方法已经开发出来。引入胚胎干细胞的基因改变可以通过将基因改变的胚胎干细胞注射到小鼠早期胚胎中形成嵌合体而传递到小鼠生殖系。同时，基因靶向和ES细胞技术使研究在活的有机体内通过内源性基因的修饰来改变基因的功能。

GEMF服务

由研究人员提供的靶向载体将通过电穿孔导入ES细胞。这些细胞将在适当的选择培养基上生长。从存活下来的克隆细胞中提取的DNA将提供给研究人员进行Southern或PCR分析。阳性克隆将被扩增和冷冻，并将保留在GEMF内，以便后续进行囊胚注射或给予研究人员(应要求)。

成本

MD安德森调查人员每建筑5000美元;MD·安德森下属的调查人员每构建8200美元;其他外部调查人员每建筑$13 284

基因靶向在ES细胞中的时间线

• 第1天:启动ES细胞培养进行电穿孔
• 第5天:电孔靶向载体
• 第六天:开始药物选择
• 第16天:挑选所有存活的克隆，或最多3 x 96孔板(共288个)单或双抗性菌落(可以挑选额外的板)。联系设施经理了解当前的价格。)
• 第20天:将ES细胞在4 × 96孔板上分离培养(对于每一个选择的96孔板)，2个重复在-80°C下暂时冷冻，其余2个生成DNA供研究者进行重复Southern分析
• 第23天:从96孔板中提取DNA，提供给调查者筛选。

单元格扩展的时间线

• 第1天:根据Southern杂交的结果扩展3个目标克隆(可以扩展更多的克隆)。联系设施经理了解当前的价格。)
• 第六天:向调查员提供大规模DNA进行再次确认
• 第21天:在液氮中冷冻细胞

点考虑

基因靶向实验费时费力。以下是设计基因靶向实验时要考虑的一些要点，以避免代价高昂的延迟。

基因组DNA来源

在构建靶向载体时，使用与ES细胞系同基因的基因组DNA来确保同源重组是非常重要的。我们目前有129SvEv (S6)， 129/SV/J (X1)和混合129SvEv/C57BL/6 ES细胞系，我们通常在我们的设施中使用。如果事先与该设施作出安排，以确保相同背景的ES细胞系的可用性，则可以使用其他遗传背景。

靶向ES细胞克隆的鉴定策略

确定确定目标克隆的方案是基因靶向实验最重要的部分。该策略必须经过严格的测试并证明是可靠的和可复制的。由于这方面的实验是如此关键，并且经常被证明是有问题的，GEMF要求每个研究人员提交数据，以证明他们的策略的可行性，并在任何胚胎干细胞工作开始之前提交Southern分析，以证明探测器的效用。

在设计策略时需要考虑的方面如下:

• 南方分析被强烈推荐用于同源重组的检测
• 诊断限制性内切酶的选择应使靶向细胞克隆和非靶向细胞克隆之间存在明显的大小差异
• 根据经验，我们已经能够根据酶在小型南方人身上的表现对其进行分类(见下文)。试着尽可能地遵守这个清单
• 识别5 '和3 '外部探针，用于南方基因分析，为南方基因提供良好信号。两个探针都应该在靶向载体中使用的同源区域之外

从GEMF获取服务

• 预约Jan Parker-Thornburg(电话:713-745-2654或发电子邮件)jpthorn@mdanderson.org)检讨目标定位策略。我们将涵盖实验设计，从目标向量的构建到目标事件的诊断分析方法
• 向GEMF提供机构生物安全委员会(IBC)的DNA重组研究批准号188bet体育网址
• 登录到https://mdanderson.ilabsolutions.com，注册一个帐户，然后去网站请求服务
• 为设施提供根据指定协议制备的目标载体。同时还将提交一份详细的靶向载体图和识别靶向克隆的策略，以及用于分析的试点实验结果
• 当电穿孔和选择完成后，实验室将为研究人员提供包含从选定的ES细胞克隆中未切割的基因组DNA的复制96孔板。研究人员应对这些dna进行基因组Southern分析，并将得到的胶片带到实验室进行审查。三个阳性克隆将被扩增，从每个被选择的克隆中提取的DNA将被提供给南方基因组分析的确认
• 冷冻的靶向胚胎干细胞将保存在设施中，用于后续的囊胚注射，或可根据研究人员的要求提供

读了政策和程序章节以获取有关GEMF提供的服务的重要信息。

请注意基因靶向是一项既昂贵又耗时的实验。因此，必须仔细考虑并有系统地规划目标战略。通过在基因靶向策略的精心设计上投入时间，您可以节省时间、金钱和研究动物的生命。188bet体育网址